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WB实验中化学发光成像系统的使用
加入日期:2018.10.22   浏览次数:280次    字体大小:       
WB实验中化学发光成像系统的使用   一般的WB检测过程中,都会有膜的封闭、一抗孵育、二抗孵育和底物显色这四道“加工”工序。最后的底物显色是最关键的一部,也是最有文章可作的一个部分。   WB显色的方法主要有放射自显影、底物化学发光ECL、底物荧光ECF和底物DAB呈色四种方法,发表文章通常是用底物化学发光ECL,操作比较简单,只需要购买现成的化学发光检测试剂盒即可。试剂盒中一般使用的反应底物A和B分别是鲁米诺(又名发光氨) 和过氧化氢,原理如下(二抗用HRP标记):在HRP的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物,过氧化物不稳定随即分解,形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态,就会产生荧光,可用X胶片和成像设备进行检测。使用传统的X胶片显影方法进行WB实验时,最后需要使用暗室曝光来进行ECL检测,但是建造暗室浪费空间,在暗室中曝光步骤繁琐,冲洗X光片时会接触有毒的化学药剂。化学发光成像设备能够对ECL发光直接成像,获得实验结果,避免暗室曝光的不便。   是否能够拍摄到ECL的图像主要取决于设备是不是带有制冷的CCD,只有制冷的CCD才够灵敏地捕捉到膜上发出的光。随着Cooled-CCD技术的发展,成像系统成本越来越低,因而在现在的实验室里这些设备越来越普遍。本实验室目前采用的是化学发光成像系统,具有灵敏度高,成像速度快、成像效果清晰等优点。   该仪器的使用非常简单:   1)在使用前开机预冷,待仪器温度降到-20℃才可以进行检测;   2)将化学发光检测试剂盒中的A和B按照1:1混合;   3)PVDF膜正面朝上放于暗箱,用移液枪将发光液均匀地涂在膜上,关闭暗箱箱门,进行曝光;   4)曝光可以自动曝光,也可手动曝光,一般先点击自动曝光,观察成像效果,若不理想可再手动调节曝光时间;   另外该仪器还具有多张拍摄模式,可将一张膜在不同的曝光时间下连拍6张,使曝光更方便。   内参一般显影15s(影像条带粗细深浅一致说明内参已调齐),内参好说明各步实验操作均无误,即可进行后续的目的蛋白检测,目的蛋白结果的好坏就取决于其表达量以及抗体的特异性和效价了。   与X胶片相比,化学发光成像系统具有瞬时影像处理、立即输出、不需要胶片处理装置及暗室等成本花费、可用软件半定量分析等优点,因而在现在的实验室里化学发光成像系统的使用已经逐渐取代传统的暗室压片曝光检测。
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